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Laboratorio de Investigaciones Marinas y Acuicultura (LIMIA)

larvas de pulpo

DATOS DEL PROYECTO

El Plan Nacional de Cultivos Marins JACUMAR "Nutrición y alimentación de paralarvas i subadultos del pulpo de roca (Octopus vulgaris) (NUTRIPULPO)" consiste en desarrollar diversas experiencias para conseguir un método de obtención de juveniles para el engorde y para formular peinsos adecuados para el engorde. 

 

 

ANTECEDENTES

El pulpo de roca (Octopus vulgaris) es una especie que presenta gran potencial en el sector de la acuicultura marina. Gracias a sus características biológicas - rápido crecimiento, elevada eficacia de conversión del alimento, alta fecundidad, resistencia a la manipulación y adaptación a la vida en cautividad - y elevado valor comercial, ha despertado el interés de numerosas empresas en el litoral español. No obstante, y a pesar de que se ha avanzado bastante en el conocimiento de aquellos aspectos biológicos y técnicos relacionados con su cría, el desarrollo industrial del pulpo se encuentra aún limitado debido a la imposibilidad de obtener masivamente subadultos en cautividad, así como a la ausencia de piensos artificiales elaborados industrialmente con la apropiada composición nutritiva, que sean aceptados por los animales y garanticen unos rendimientos satisfactorios.

 

OBJETIVOS

  • Acondicionamiento de reproductores y obtención de puestas viables.
  • Sistema de cultivo de paralarvas utilizando sistemas semi-extensivos, también llamados mesocosmos.
  • Sistema de cultivo intensivo de paralarvas utilizando como presas Artemia engordada y posteriormente enriquecida con fitoplancton y enriquecedores. Acondicionamiento de reproductores y obtención de puestas viables.

 

El stock del año 2010 se obtuvo mediante captura por una embarcación de arrastre en las cercanías a la isla Dragonera. Una vez sacados del copo, se introdujeron en un balde y se transportaron al Laboratorio de Investigaciones Marinas y Acuicultura, donde se estabularon en un tanque de 10 metros cúbicos al 50% de su capacidad, con una renovación de 40 l/m y sin aireación, cubierto por una tela sombreadora durante los primeros días. Posteriormente, se colocó una tapa de plástico rígido traslúcido y la misma tela sombreadora. En el interior del tanque se dispusieron refugios elaborados con tubos de PVC rígido, de 20 cm de diámetro, que se sustituyeron por otros, de 50 cm de diámetro para adaptarlos al tamaño de los pulpos. A la semana, se muestrearon y se marcaron con una marca tipo T-anchor para identificarlos. La marca la perdieron a los pocos días. El peso medio fue de unos 350 gr.
De los 21 ejemplares obtenidos, 3 murieron durante los primeros días por las heridas y el stress sufrido durante la captura y transporte. Durante el periodo de estabulación el número de pulpos se redujo a 10, por peleas y escapes.
También se obtuvieron pulpos mediante nasas y pulperas dispuestas en el muelle del laboratorio. Se obtuvieron 6 machos, que se devolvieron al mar y una hembra de 1,540 kg que se estabuló en un tanque de 1 metros cúbicos, que se cubrió de manera similar al tanque de 10 metros cúbicos.
La alimentación consistió en boga, jurel, alacha, caramel, mejillón, gamba y cangrejo, aproximadamente un 5% del peso de los ejemplares.
De las 4 hembras, sólo se obtuvieron 2 puestas viables. De la tercera, la puesta no llegó a eclosionar y la cuarta no llegó realizar la puesta y falleció a principios de agosto.

Los resultados se resumen en la tabla siguiente:

Tabla de resultados

Entre octubre del 2011 y marzo del 2012 se capturaron y estabularon un total de 10 ejemplares, de los cuales 9 eran hembras y 1 macho. Algunas hembras ya venían fecundadas del mar ya que se capturaron durante su época de reproducción.

Una vez en el laboratorio se pesaban y determinaba el sexo de éstos. Mientras son pequeños se separan en tanques distintos según el tamaño y el sexo ya que en ocasiones se han observado peleas y canibalismo. Posteriormente se introducen en un tanque rectangular de 10 toneladas, en circuito abierto (40 L min-1), lleno hasta la mitad de su altura, cubierto con tela sombreadora y a temperatura ambiente. En su interior se disponen refugios de ladrillo o de tubos de PVC de 25cm de diámetro, en donde los pulpos pueden fijar sus puestas.
Seis hembras realizaron puesta y fueron aisladas en tanques diferentes tapados con tela sombreadora y mantenidas en ayuno. En la tabla a continuación se presentan las características de éstas:

 Tabla resultados

 Puesta de pulpo fijada a un tubo de PVC. Detalle de dos racimos en los que se observan los huevos

 

De estas 6 puestas, sólo 4 han llegado a eclosionar (las de las hembras H1, H2, H3 y H5). Las otras dos no, debido al fallecimiento de las madres. La duración de la eclosión fue de entre 11 y 20 días. La cantidad de paralarvas varió bastante de unas eclosiones a otras, con un mínimo de 30.850 y un máximo de 398.520.
La duración del desarrollo embrionario en todas las puestas es de aproximadamente 30 días debido a las altas temperaturas del agua en la época de la puesta (22-24°C). Durante este tiempo los huevos de pulpo han pasado por varias fases de desarrollo.

 

Eclosión masiva de paralarvas. Al fondo se observa la madreParalarvas recién eclosionadas

Embrión de un díaHuevo en una etapa intermedia. Estadio X-XII.

Huevo en estadio XV-XVI. Se observa el vitelo frente a la boca.Huevos en un estadio avanzado: XVIII. El vitelo se ha reducido

 

Las puestas de las hembras H1 y H2 no se utilizaron para el cultivo larvario. La puesta de la H1 fue reducida y la de la H2 se solapó con la de la H5. Las eclosiones de las de la hembras H3 y H5 fueron numerosas y las paralarvas se usaron en las distintas pruebas de cultivo larvario. En la tabla siguiente se resumen las características de las puestas:

 

Características de las dos hembras que se usaron para las experiencias, de sus puestas y de las paralarvas resultantes

Una de las hembras, la H5, que inició su puesta el 19 de junio, murió a los 6 días por causas desconocidas. Los huevos quedaron sin protección y se optó por utilizar a otra hembra (H1) como madre adoptiva cuya puesta ya había acabado de eclosionar. La aceptación de la nueva puesta fue casi instantánea. La hembra se encargó de su cuidado y limpieza desde el 25 de junio hasta el 1 de agosto, día en el que murió.
Una vez que la hembra falleció, el cilindro con las puestas se aisló en un tanque de 250 L, colocando un difusor de aire en el fondo del refugio con poco caudal de aire, para que se oxigenen los racimos de huevos y al mismo tiempo se hace incidir un chorro de agua de mar limpia y filtrada a 100 µm. De esta manera se consiguió que aproximadamente eclosionasen algo más de 4000 paralarvas, quedando bastantes huevos sin eclosionar.

 

Cultivo larvario de pulpo en sistema mesocosmos


2011

Se realizó una prueba preliminar del funcionamiento del mesocosmos a principios de mayo, obteniéndose un boom de fitoplancton en unos 15 días. En ese momento, se añadió 10 millones de nauplios y se mantuvo en estas condiciones hasta el día 10 de junio, en que se detecto la primera puesta.
El 20 de junio preparó el tanque exterior, con unos 40 metros cúbicos de agua para el cultivo de paralarvas en un mesocosmos.
La preparación consistió en el vaciado del tanque, seguido de una limpieza con agua a presión y posterior rellenado con agua cruda. Una vez llenado el tanque, se colocaron aireadores en el fondo y se fertilizó el tanque con 200 gr de nitrógeno y 20 gr de fósforo.
A los 15 días, se añadieron 20 millones de nauplios recién eclosionados de Artemia. Durante los 5 días siguientes se añadieron 10 millones más diarios. La densidad de Artemia fue de 1/ml antes de la siembra de paralarvas.
Se sembraron 86700 paralarvas entre los días 7 y 10 de julio (2,2 paralarvas/l). Se controlaron los siguientes parámetros: Temperatura, pH, O2, salinidad, clorofilas y amonio.
La temperatura media fue de 26,07±0,6614 ºC, el pH medio de 8,23±0,1222, la concentración media de O2 de 5,98±0,2700 ppm y la salinidad media de 37,4±0,2988‰. El amonio se midió con un kit y se mantuvo por debajo de 0,25 mg/l hasta el 4 de agosto, momento en que se abre el circuito y se renovó el 10% diario del volumen.
Cada día se comprobaba la presencia de larvas. A partir del día 7 no se observan larvas, pero se mantiene el mesocosmos como fuente de Artemia para los tanques de cultivo intensivo.

 

Parámetros ambientales del mesocosmos. Las barras indican el día de siembra de las paralarvas y el número de paralarvas introducidas

 

2012

Para la obtención de un afloramiento de zooplancton natural se llenaron dos tanques con agua de mar sin filtrar: uno situado en el exterior del laboratorio, de 60 metros cúbicos y otro en el interior, de 5 metros cúbicos. La iluminación del tanque exterior era natural y la del tanque interior mediante fluorescentes a una intensidad de 800 luxes con fotoperiodo de 24 horas de luz. La renovación del agua era de un 10% diaria. Se fertilizó el medio añadiendo abono (Abono Azul Universal NovaTec, Compo) a una concentración de 80 g·metros cúbicos, para provocar un boom de fitoplancton y zooplancton.
No se realizó ningún seguimiento, excepto varios test de amonio para comprobar los niveles de este ión en el agua. En alguna ocasión se aportó a los tanques Artemia de 5 días enriquecida. Se añadieron paralarvas recién eclosionadas durante varios días dependiendo de las eclosiones obtenidas. En total, en el tanque exterior se sembraron 289.672 paralarvas y en el tanque interior 46.266 especímenes.

 

Tanque interior donde se realizaron las experiencias de mesocosmos. Tanque exterior donde se realizaron las experiencias de mesocosmos.

 

En ambos tanques se observó una mortalidad total a los pocos días después de cada siembra. Las causas de esta mortalidad son desconocidas.

 

Cultivo de paralarvas


2011


Las hembras con puesta se separaron en tanques de 120 l, en oscuridad y con una renovación de 20 l/min. Aproximadamente, a los 25 días empezó la eclosión. Las paralarvas se retiraban con sumo cuidado del tanque donde habían eclosionado mediante jarras y sifones. Toda la puesta se concentraba en un balde de 60 l para facilitar su contaje por volumetría. La siembra se realizó en distintos tanques y densidades de cultivo:
• 3 tanques de 0,4 metros cúbicos a una densidad máxima de 25-30 paralarvas/l.
• 3 de 1 metros cúbicos a un densidad de 15-20 paralarvas/l (máximo, 28/l).
• 1 tanque de 10 metros cúbicos, con densidad de 15-20 paralarvas/l.

 

 Diferentes momentos de la incubación, eclosión y siembra en tanquesDiferentes momentos de la incubación, eclosión y siembra en tanques

Diferentes momentos de la incubación, eclosión y siembra en tanquesDiferentes momentos de la incubación, eclosión y siembra en tanques

 

De las distintas puestas se recogió una muestra inicial para determinaciones bioquímicas (1 g de paralarvas). Una vez comenzados los cultivos se muestreaban 10 paralarvas cada cuatro días para determinar las variaciones en la longitud corporal. La única experiencia de cultivo en la que se pudo realizar fue la del tanque TL1.

No se recogieron muestras del día 15 en ninguna de las experiencias de cultivo, debido a que sólo en dos tanques se superó el día 15 de cultivo, quedando muy pocas paralarvas. Por este motivo, y tal como se decidió en la reunión de coordinación, no se procesaron debido a la escasa supervivencia de los cultivos.

 

Tabla resultados crecimiento paralarvas

Crecimiento de las paralarvas. La medición mediaate una lupa Olympus acoplada a un sistema de análisis de imagen.
 

La alimentación se proporcionaba en 2 tomas diarias. Para alimentar a las paralarvas se utilizaron nauplios de Artemia Tyca durante los primeros 14 días. A partir del día 15 se les proporcionó metanauplios de 4 días de Artemia GSL 85%.
Durante los primeros 7 días, los tanques se mantuvieron en circuito cerrado, con aireación muy suave.
Diariamente, se comprobaba la concentración de Artemia que quedaba en el tanque de cultivo. Si ésta era elevada se abría el circuito de agua durante 3 horas para eliminarla, estableciendo un flujo que permitía la renovación del 100% del volumen del tanque. Al cerrar la entrada de agua se contaba por volumetría la cantidad de Artemia que quedaba en el tanque y se ajustaba la primera toma (10:00 h) a 0,25 Artemias/ml. La segunda toma (14:00 h) consistía en 0,25 Artemias/ml, 0,01 ml /l de phytobloom y 0,003g/l de Thalassiossira liofilizada. En los tanques TL (1000 l), la segunda toma se hacía mediante bombas peristálticas y el resto a mano.

Cuando se producían mortalidades más o menos elevadas se sifonaba suavemente el fondo de los tanques para eliminar los restos.


Resumen de los diferentes cultivos realizados

Resumen de los diferentes cultivos realizados. Se han resaltado los que se obtuvieron mejores resultados.

2012


Cultivo a diferentes temperaturas


Unas 18.000 paralarvas recién eclosionadas se transfirieron a 6 tanques de fibra de 200 litros, resultando una concentración de 15 individuos/L (en total, unas 3.000 paralarvas por tanque). Los tanques eran circulares, de 1 m de diámetro y con paredes y fondo blanco. De los 6 tanques, tres se ajustaron a una temperatura de 21°C y otros tres a 24-26°C. La salinidad era de 37‰. Se estableció un ciclo de 24 horas de luz, mediante dos tubos fluorescentes por tanque, resultando en una intensidad de 500-700 lux en la superficie del agua. Los tanques se mantuvieron en circuito ligeramente abierto (0,3 L/min) con aireación central muy suave. Se añadieron diariamente microalgas liofilizadas (Isochrysis galbana a una concentración de 0,375 millones cél/mL y Nanochloropsis gaditana a 0,12 millones cel/mL, EasyAlgae, España). El fondo del tanque se limpió por sifonado cuando se creía necesario y se observaban bajas en el fondo. Las paralarvas fueron alimentadas dos veces al día (9:00 y 14:00 horas) con metanauplios de Artemia cultivados como se ha descrito anteriormente. La concentración de Artemia se ajustó en ambas tomas a 0,5 individuos/mL. En la salida del agua se colocaron mallas de 315 μm para evitar el escape de la Artemia.


Cultivo en aguas verdes


En este estudio se analizaron los efectos de añadir fitoplancton a los tanques de cultivo de paralarvas. Se sembraron 15.000 paralarvas por tanque en seis tanques circulares de 1.000 L (densidad 15 paralarvas/l). La temperatura del agua se mantuvo a 21°C mediante el uso de climatizadores y se estableció un flujo de agua de unos 0,8 l/min. La alimentación, como en la experiencia anterior, se hizo con Artemia adulta de 5 días enriquecida, a una concentración de 0,5 metanauplios/ml. Se establecieron dos grupos, cada uno por triplicado: el primero se mantuvo en condiciones de aguas claras mientras que en el segundo se establecieron las condiciones de aguas verdes añadiendo diariamente fitoplancton liofilizado (Isochrysis galbana a una concentración de 0,375 millones cél/ml y Nanochloropsis gaditana a 0,12 cel/ml, EasyAlgae, España).
En todos los experimentos se determinaron los siguientes parámetros:
· Supervivencia. Cuando se observaban paralarvas muertas en el fondo de los tanques se sifonaban y se determinaba el número de bajas mediante su contaje por volumetría. Cuando ya quedaban pocas paralarvas vivas en los tanques se contaban una a una.
· Peso seco de las paralarvas a los días 0, 15, 30, etc. Para su determinación se lavaban 10 paralarvas con agua destilada para eliminar los restos de sal. Se colocaban en un portaobjetos previamente tarado y se eliminaban los restos de agua mediante succión con una jeringuilla y papel secante. Se pesaban en húmedo con una balanza de precisión y se colocaban en una estufa a 60°C hasta obtener peso constante (24 horas). Posteriormente se pesaban en la misma balanza para determinar el peso seco.

Paralarva recién eclosionada. Medida de la longitud del manto hecha con el programa Cell^D, de Olympus
Paralarva recién eclosionada. Medida de la longitud del manto hecha con el programa Cell^D, de Olympus.

· Longitud del manto (LM) y longitud total (LT) a los días 0, 15, 30, etc. Para su determinación se realizaron fotografías mediante una cámara acoplada a una lupa usando el programa analySIS genII, Olympus. Primero se anestesiaban las paralarvas con una solución de etanol al 1%. Con un programa de procesamiento de imágenes (Cell^D, Olympus) se midió la longitud del manto como la distancia entre el extremo posterior del cuerpo y el punto medio entre los ojos.
· Recuento del número de ventosas por tentáculo.
· Histología. Se recogieron unas 30 paralarvas a los días 0, 15, 30, etc. y se almacenaron fijadas en formol al 10% tamponado con fosfatos, a la espera de su posterior análisis.
· Bioquímica. Se recogió una muestra de las paralarvas recién eclosionadas para su posterior análisis bioquímico. Se colocaron en un criotubo que se conservó a -80°C. También se recogieron muestras del alimento (Artemia). 


Resultados y discusión


Cultivo a diferentes temperaturas

 

Los resultados de esta experiencia no fueron concluyentes debido a fallos en el sistema de refrigeración del agua. En varios tanques se registraron variaciones de hasta 2 grados, solapándose los grupos de temperatura baja y alta.
El tanque E1 presentó una mortalidad total a día 5 de cultivo debido a variaciones de temperatura de hasta 4,8°C. El resto de tanques sufrieron una mortalidad similar a los 14-18 días.
Estos resultados no permiten sacar conclusiones en cuanto a la temperatura a la cual se obtienen mejores resultados, por lo que se pretendía repetir la experiencia el año 2013.

 

Edad final de las paralarvas en los distintos tanques de cultivo.

 

  Edad final de las paralarvas en los distintos tanques de cultivo.

Cultivo en aguas verdes

El uso de la técnica de aguas verdes para cultivar especies marinas es una práctica bien conocida en acuicultura y ha demostrado que mejora la supervivencia, crecimiento e índice de conversión de más de 40 especies en comparación con las condiciones de aguas claras.

 Paralarvas de pulpo en los tanques de cultivo en condiciones de aguas verdes Paralarvas de pulpo en los tanques de cultivo en condiciones de aguas claras.

 Paralarvas de pulpo en los tanques de cultivo en condiciones de aguas verdes o aguas claras.

 

Las paralarvas criadas en condiciones de aguas verdes sobrevivieron hasta día 46, a diferencia de las paralarvas criadas en aguas claras, que sólo llegaron hasta el día 35. Esta diferencia parece indicar los posibles efectos beneficiosos del sistema de aguas verdes.
Si analizamos cada tanque por separado (existen 3 tanques para cada tipo de cultivo) se aprecian grandes diferencias dentro del mismo tipo de cultivo. A día 4, en uno de los tanques de aguas verdes mueren todas las paralarvas, sin saber con certeza la causa. Es probable que quedaran restos de pegamento de una reparación que se hizo al tanque un día antes de introducir las paralarvas. Esto hace que la media de este grupo disminuya. Si obviamos este tanque, las diferencias entre un sistema de cultivo u otro son todavía más acusadas. En los dos tanques restantes se llega a una edad final de 45 y 46 días. En cambio, en los tanques sin aporte de fitoplancton, dos tanques llegan a día 20 y uno a los 35 días.

Tasa de supervivencia de las paralarvas de pulpo cultivadas en condiciones de aguas verdes o claras a lo largo del experimento. Medias ± S.D. (n=3).

Tasa de supervivencia de las paralarvas de pulpo cultivadas en condiciones de aguas verdes o claras a lo largo del experimento. Medias ± S.D. (n=3). 
Tasa de supervivencia de cada uno de los tanques de cultivo por separado: tres de aguas claras y tres de aguas verdes
Tasa de supervivencia de cada uno de los tanques de cultivo por separado: tres de aguas claras y tres de aguas verdes.

 

Como se observa, se han conseguido criar paralarvas hasta los 46 días de edad, con una supervivencia en uno de los tanques del 0,5% (73 paralarvas vivas de las 15.000 iniciales).
Este resultado es, en esta especie, un número bastante elevado teniendo en cuenta que sólo se le aporta como alimento Artemia enriquecida.

 

Edad alcanzada por las paralarvas en cada tanque de cultivo

Edad alcanzada por las paralarvas en cada tanque de cultivo.

La muerte de estas paralarvas, a día 46, se produjo de forma masiva y repentina, sin saber exactamente las causas de tal acontecimiento. Se cree que puede ser debido al aporte, por primera vez, de Artemia adulta descongelada. Se observó que las paralarvas la aceptaban y capturaban, pero al día siguiente todas las paralarvas aparecieron muertas. Lo mismo sucedió el mismo día con otro tanque de una experiencia diferente, al que también se le aportó la Artemia adulta congelada.

 

Crecimiento

 

A los 15 días de cultivo no se observaron diferencias significativas en el crecimiento en longitud entre las paralarvas a las que se les había suministrado fitoplancton al agua de cultivo y a las que no. No se pueden analizar diferencias posteriores al no poseer datos suficientes del cultivo de aguas claras ya que debido a las pocas paralarvas existentes no se pudo determinar el peso.
En aguas verdes, las paralarvas crecieron 1.274,71±175,36 μm en 45 días en cuanto a longitud del manto, y 2.008,21 ± 168,21 μm en cuanto a longitud total. Se empieza a observar un crecimiento diferencial de los tentáculos frente al resto del cuerpo.

Incremento de longitud del manto y longitud total respecto de la talla inicial en las paralarvas criadas en aguas verdes y en aguas claras.
Incremento de longitud del manto y longitud total respecto de la talla inicial en las paralarvas criadas en aguas verdes y en aguas claras.

:  Paralarva recién eclosionadaParalarva de 15 días de vida.

Paralarva de 30 días de edadParalarva de 45 días de edad

 Paralarvas de 0, 15, 30 y 45 días.
 

En cuanto al crecimiento en peso, tomando los datos del mejor resultado (aguas verdes) se observa que sigue un modelo exponencial, cuya ecuación resulta en:

 

Peso seco (mg) = 0,2443e0,0428(edad)

 

Estas paralarvas casi cuadriplicaron su peso seco en un periodo de 30 días, pasando de 0,26 a 0,95 miligramos, con una supervivencia del 1,8%.
Comparando los resultados con los obtenidos por el grupo del IEO de Vigo con Artemia enriquecida, los valores de peso seco que se obtienen son algo mayores que los nuestros: 1,4 mg y una supervivencia del 10% a los 30 días. Las diferencias son incluso más grandes si se comparan con resultados obtenidos con aporte de zoeas de centolla vivas: se obtienen a los 45 días valores de 9,5 ± 1,9 mg con un 31,5% de supervivencia.

 

Peso seco de las paralarvas criadas en aguas verdes

Peso seco de las paralarvas criadas en aguas verdes.

Comparación del crecimiento en peso seco de las paralarvas obtenidas en el LIMIA respecto a las obtenidas en el IEO deVigo

Comparación del crecimiento en peso seco de las paralarvas obtenidas en el LIMIA respecto a las obtenidas en el IEO deVigo ( alimentadas con Artemia o con Artemia y zoeas de centollo).  

Número de ventosas


Las paralarvas, al nacer, presentan tres ventosas en cada tentáculo. Este número va aumentando a medida que la paralarva crece. A los 45 días casi la totalidad de paralarvas observadas poseían todavía 3 ventosas y sólo en algunas se observó una cuarta. En cambio, en los resultados de Iglesias et al., 2004, a los 40 días de edad, las paralarvas ya poseían un número medio de 23 ventosas por brazo.

Paralarva de 45 días. Flecha: inicio del crecimiento de la cuarta ventosa

Paralarva de 45 días. Flecha: inicio del crecimiento de la cuarta ventosa.

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